Edycja genomu i przyszłość

Wprowadzenie
Od czasu odkrycia DNA rozwinęło się kilka technologii umożliwiających genetyczną manipulację organizmami w celu uzyskania lepszych zastosowań w rolnictwie i przemyśle. Techniki sekwencjonowania nowej generacji ułatwiły identyfikację różnych genów i mutacji w DNA. Stosowane od dłuższego czasu techniki GMO i klonowania są bezpośrednim skutkiem postępu w tej dziedzinie. Te techniki klonowania były wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań medycznych, rolniczych, przemysłowych i badawczych przez ostatnie kilka dziesięcioleci. Jednakże pomimo całego rozwoju i postępu istnieje ciągłe zapotrzebowanie na bardziej zaawansowane techniki edycji genów, które byłyby precyzyjne i dokładne. W ciągu ostatniej dekady wzrosło wykorzystanie programowalnych nukleaz do modyfikacji genetycznych ze względu na ich potencjał w leczeniu różnych chorób dziedzicznych i nowotworów. W ostatniej dekadzie wyszły na światło dzienne trzy główne klasy programowalnych nukleaz – nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i skupione regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) – związane z Cas9 (CRISPR/Cas9). .

Nukleazy palca cynkowego (ZFN)
ZFN były najwcześniej opracowanym narzędziem do edycji genomu, charakteryzującym się większą precyzją pod względem możliwości zmiany zawartości genetycznej. ZFN składają się z dwóch domen, powtarzalnych białek palca cynkowego (ZFP), których domeny wiążące DNA są połączone z niespecyficzną domeną rozszczepiania DNA endonukleazy restrykcyjnej FokI. ZFN działają jako dimer, w którym każda jednostka monomeryczna ma zdolność rozpoznawania od 18 do XNUMX par zasad (bps) DNA poprzez domenę wiążącą DNA palca cynkowego. Istnieje szeroka gama domen palca cynkowego, które rozpoznają odrębne trojaczki DNA. Można je łączyć ze sobą w celu wytworzenia białek polidaktylowego palca cynkowego, które mogą atakować szeroki zakres możliwych sekwencji DNA. Jednak głównym problemem związanym z edycją genów w oparciu o ZFN jest niewłaściwa edycja/mutacje. Dlatego istnieje duże pole do poprawy efektywności tego procesu.

Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN)
TALEN pojawiły się jako alternatywa dla ZFN do edycji genomu. Podobnie jak ZFN, TALEN składają się z dwóch programowalnych domen wiążących DNA połączonych z domeną endonukleazy FokI i działają poprzez wprowadzenie pęknięć dwuniciowych (DSB). Efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE) są naturalnie wydzielane przez Xanthomonas spp. bakterii, która wiąże się z DNA organizmu gospodarza. Domena wiążąca DNA TALE składa się z wielu powtórzeń mających 33-35 aminokwasów, przy czym każde powtórzenie rozpoznaje pojedynczy nukleotyd. Swoistość domeny wiążącej DNA TALE wynika z obecności regionów hiperzmiennych obecnych w każdej domenie w pozycjach 12 i 13 aminokwasów. Zatem TALEN specyficzne dla sekwencji można wygenerować poprzez modyfikację tych reszt aminokwasowych w regionach hiperzmiennych i połączenie ze sobą różnych powtórzeń TALE.

Zgrupowane, regularnie rozmieszczone, krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) powiązane z Cas9 (CRISPR/Cas9)
Oprócz ZFN i TALEN, CRISPR/Cas9 to kolejne szybko rozwijające się narzędzie do edycji genów. Jest to naturalnie występujący układ bakteryjny, który działa jako składnik odporności nabytej bakterii. Zapewnia ochronę bakteriom przed inwazją wirusów i plazmidów poprzez cięcie DNA pod kontrolą RNA przez białko Cas. Istnieją trzy główne składniki systemu CRISPR/Cas9 – CRISPR RNA (crRNA), transaktywujący crRNA (tracrRNA) i enzym Cas9. CrRNA ulega transkrypcji z układu inwazyjnego i jest znane jako sekwencja protoprzerywnika i hybrydyzuje z tracrRNA, które wyzwala i działa jako podstawa wiązania nukleazy Cas9 z miejscem cięcia DNA. W przeciwieństwie do systemów ZFN i TALEN, które rozpoznają określone sekwencje w danej sekwencji genomu przy użyciu różnych białek rozpoznających, system CRISPR/Cas wykorzystuje sekwencję RNA komplementarną do docelowej sekwencji genomowej. Zaleta hybrydyzacji RNA w rozszczepieniu specyficznym dla miejsca powoduje zastosowanie chimerycznego „przewodnika” RNA (gRNA) do edycji genomu, który powstaje w wyniku fuzji razem crRNA i tracrRNA. gRNA zawiera 20 nukleotydowych sekwencji kierujących zaprojektowanych do wiązania się z określonymi sekwencjami DNA. Dlatego gRNA i Cas9 są w stanie skanować odpowiednie miejsce i wiązać się z nim w celu utworzenia specyficznych dla miejsca pęknięć podwójnej nici (DSB). Zatem system CRISPR/Cas9 oferuje stosunkowo dokładniejszą technikę edycji genów w porównaniu z poprzednimi technikami i może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań.

Podsumowanie
Jak dotąd jest oczywiste, że obecne mechanizmy edycji genów są bardziej precyzyjne i mają szeroki zakres zastosowań bez większych implikacji etycznych i fizjologicznych. Dlatego nieuniknione są większe korzyści finansowe i ciągłe doskonalenie w tej dziedzinie. Również racjonalne badania i rozwój, właściwa identyfikacja celów i ochrona własności intelektualnej są istotne dla rozwoju terapii, produktów biologicznych i procesów nowej generacji.